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                                                                                                          关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

                                                                                                          ChIP实验原理

                                                                                                           

                                                                                                          在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结?#31995;腄NA片段,通过对目的片?#31995;?#32431;化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

                                                                                                          可以利用ChIP研究转录因子( transcription factor, TF)与启动子(promoter)的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的?#20174;?#32454;胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结?#31995;?#23454;验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当TF与Promoter相互结合(生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近,或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。

                                                                                                          一般ChIP的流程是:甲醛处理细胞——收集细胞,超声破碎——加入目的蛋白的?#22266;澹?#19982;靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A,结合?#22266;?靶蛋白-DNA复合物,并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合——洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联,纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

                                                                                                           

                                                                                                           

                                                                                                          ChIP实验步骤

                                                                                                          第一天:
                                                                                                          (一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。
                                                                                                          1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%。(培养基共有9ml)
                                                                                                          2、37摄氏度孵育10min。
                                                                                                          3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。
                                                                                                          450ul 2.5M甘氨酸于平皿?#23567;?#28151;匀后,在室温下放置5min?#32431;傘?BR>4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。
                                                                                                          5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS?#26469;?#20026;5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
                                                                                                          6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。
                                                                                                          假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此?#25239;?#21152;入400ul SDS Lysis Buffer。
                                                                                                          将2管混在一起,共800ul。
                                                                                                          7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。当然,如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。



                                                                                                          (二)、除杂及?#22266;?#21754;育。
                                                                                                          8、超声破碎结束后,10,000g 4度离心10min。去除不溶物质。
                                                                                                          留取300ul做实验,其余保存于-80度。
                                                                                                          300ul中,100ul加?#22266;?#20570;为实验组;100ul不加?#22266;?#20570;为对照组;100ul加入4ul 5M NaCl (NaCl终浓度为0.2M),65度处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。
                                                                                                          9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
                                                                                                          再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。
                                                                                                          10、1h后,在4?#26579;?#32622;10min沉淀,700rpm离心1min。
                                                                                                          11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul ?#22266;澹?#21478;一管?#24615;?#19981;加?#22266;濉?度颠转过夜。

                                                                                                          (三)、检验超声破碎的效果。
                                                                                                          取100ul超声破碎后产物,加入4ul 5M NaCl,65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

                                                                                                          第二天:
                                                                                                          (一)、免疫复合物的沉淀及清洗。
                                                                                                          12、孵育过夜后,?#25239;?#20013;加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
                                                                                                          4度颠转2h。
                                                                                                          13、4?#26579;?#32622;10min后,700rpm离心1min。除去上清。
                                                                                                          14、?#26469;?#29992;下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶?#28023;?#22312;4度颠转10min,4?#26579;?#32622;10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。
                                                                                                          洗涤溶?#28023;篴. low salt wash buffer----one wash
                                                                                                          b. high salt wash buffer-----one wash
                                                                                                          c. LiCl wash buffer------one wash
                                                                                                          d. TE buffer------two wash
                                                                                                          15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul 10%SDS, 100ul 1M NaHCO3, 800ul ddH2O,共1ml。
                                                                                                          ?#25239;?#21152;入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为?#25239;?00ul。
                                                                                                          16、解交联?#22909;抗?#20013;加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。
                                                                                                          混匀,65度解交联过夜。

                                                                                                          第三天:
                                                                                                          (一)、DNA样品的回收
                                                                                                          17、解交联结束后,?#25239;?#21152;入1ul RNaseA(MBI),37度孵育1h。
                                                                                                          18、?#25239;?#21152;入10ul 0.5M EDTA, 20ul 1M Tris.HCl(PH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白酶K。
                                                                                                          45度处理2h。
                                                                                                          19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂?#23567;?#26368;终的样品溶于100ul ddH2O。

                                                                                                          (二)、PCR分析

                                                                                                           

                                                                                                          ChIP技术总结
                                                                                                          (一)、关于细胞
                                                                                                          细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络,也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。
                                                                                                          一般细胞长到75%-80%比较好。

                                                                                                          (二)、关于?#22266;澹?BR>?#22266;?#26159;实验成败的致命因素之一!必须是IP级别的?#22266;澹?#21478;外如果经济条件许可的话,尽量买大厂的?#22266;濉?#19981;推荐国产?#22266;?#21644;santa cruz的?#22266;澹?#21363;使是IP级别的。
                                                                                                          单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种?#22266;?#21508;有利弊。单?#22266;?#24322;性强,背景低。但是单抗有一个致命的弱点,就是识别位点单一,而在ChIP甲醛交联的过程中,很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭,导致单?#20849;?#33021;识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题,但是多?#22266;?#24322;性较差,背景可能会偏高。
                                                                                                          一般而言,如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结?#31995;那?#22495;),选择多抗比较稳妥一些。

                                                                                                          (三)、关于交联与超声破碎!
                                                                                                          这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果,交联的程度越高,超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
                                                                                                          交联不充分,只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合,富集得到的Promoter的量不高,实验假阴性。交联过充分,基因组上结合了太多的蛋白,对超声破碎造成障碍。另外?#19981;?#22686;加背景。
                                                                                                          一般来讲,按照我的经验,交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系,交联的条件也不一样。例如:NIH-3T3的交联条件是室温(25摄氏度)下15min,1%的甲醛浓度,而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件,机器不一样,条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器,那么超声破碎对你而言就?#20999;?#33756;一碟了。
                                                                                                          一般,理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。

                                                                                                          (四)、关于操作
                                                                                                          希望尽可能的保持低温(4度)。
                                                                                                          沉淀的时候可以先在4度放置一会,等它自然沉降一些,再超低转速(500rpm等)离心使其完全沉降。
                                                                                                          虽然?#24471;?#20070;上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方,我还是希望你能够连续把它做完,直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

                                                                                                          (五)、关于解交联
                                                                                                          虽然?#24471;?#20070;上说4小时已经足够,但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里,DNA不会?#21040;猓?#36807;夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。
                                                                                                          (六)、关于DNA片段的回收
                                                                                                          需要注意的是:样品中SDS样品?#32454;擼?#26222;通的PCR产物回收试剂盒回收,很有可能会在最终的样品中混入SDS,影响PCR实验结果。
                                                                                                          小Tip:过柱前,在样品中加入一定量的异丙醇,能有效的消除SDS沉淀。

                                                                                                           

                                                                                                           
                                                                                                           
                                                                                                          关于我们 联系我们 文件下载 技术文章

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                                                                                                                                                                                                                                                                                                                          鐐瑰嚮杩欓噷缁欐垜鍙戞秷鎭? title=