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                                                                                                          技术文章
                                                                                                          文件下载
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                                                                                                          关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

                                                                                                          ChIP实验原理

                                                                                                           

                                                                                                          在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段然后通过免疫学方法沉淀此复合体特异性地富集目的蛋白结?#31995;DNA片段通过对目的片?#31995;?#32431;化与检测从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息

                                                                                                          可以利用ChIP研究转录因子 transcription factor, TF与启动子promoter的关联性由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法所以能比较真实的?#20174;?#32454;胞内TF与Promoter的结合情况这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结?#31995;?#23454;验方法所不能比拟的当用甲醛处理时相互靠近的蛋白与蛋白蛋白与核酸DNA或RNA之间会产生共价键细胞内当TF与Promoter相互结合生物意义上的结合时它们必然靠的比较近或者契合在一起这个时候用甲醛处理能使它们之间产生共价键

                                                                                                          一般ChIP的流程是甲醛处理细胞收集细胞超声破碎加入目的蛋白的?#22266;?#19982;靶蛋白-DNA复合物相互结合加入Protein A结合?#22266;?靶蛋白-DNA复合物并沉淀对沉淀下来的复合物进行清洗除去一些非特异性结合洗脱得到富集的靶蛋白-DNA复合物解交联纯化富集的DNA-片断PCR分析

                                                                                                           

                                                                                                           

                                                                                                          ChIP实验步骤

                                                                                                          第一天
                                                                                                          一细胞的甲醛交联与超声破碎
                                                                                                          1取出1平皿细胞10cm平皿加入243ul 37甲醛使得甲醛的终浓度为1培养基共有9ml
                                                                                                          237摄氏度孵育10min
                                                                                                          3终止交联加甘氨酸至终浓度为0.125M
                                                                                                          450ul 2.5M甘氨酸于平皿?#23567;?#28151;匀后在室温下放置5min?#32431;?BR>4吸尽培养基用冰冷的PBS清洗细胞2次
                                                                                                          5细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中PBS?#26469;?#20026;5ml3ml和3ml预冷后2000rpm 5min收集细胞
                                                                                                          6倒去上清按照细胞量加入SDS Lysis Buffer使得细胞终浓度为每200ul含2106个细胞这样每100ul溶液含1106个细胞再加入蛋白酶抑制剂复合物
                                                                                                          假设MCF7长满板为5106个细胞本次细胞长得约为80即为4106个细胞因此?#25239;?#21152;入400ul SDS Lysis Buffer
                                                                                                          将2管混在一起共800ul
                                                                                                          7超声破碎VCX75025功率4.5S冲击9S间隙共14次当然如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了



                                                                                                          二除杂及?#22266;?#21754;育
                                                                                                          8超声破碎结束后10000g 4度离心10min去除不溶物质
                                                                                                          留取300ul做实验其余保存于80度
                                                                                                          300ul中100ul加?#22266;?#20570;为实验组100ul不加?#22266;?#20570;为对照组100ul加入4ul 5M NaCl NaCl终浓度为0.2M65度处理3h解交联跑电泳检测超声破碎的效果
                                                                                                          9在100ul的超声破碎产物中加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50PIC
                                                                                                          再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA4度颠转混匀1h
                                                                                                          101h后在4?#26579;?#32622;10min沉淀700rpm离心1min
                                                                                                          11取上清各留取20ul做为input一管中加入1ul ?#22266;?#21478;一管?#24615;?#19981;加?#22266;?度颠转过夜

                                                                                                          三检验超声破碎的效果
                                                                                                          取100ul超声破碎后产物加入4ul 5M NaCl65度处理2h解交联分出一半用酚/氯仿抽提电泳检测超声效果

                                                                                                          第二天
                                                                                                          一免疫复合物的沉淀及清洗
                                                                                                          12孵育过夜后?#25239;?#20013;加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA
                                                                                                          4度颠转2h
                                                                                                          134?#26579;?#32622;10min后700rpm离心1min除去上清
                                                                                                          14?#26469;?#29992;下列溶液清洗沉淀复合物清洗的步骤加入溶?#28023;?#22312;4度颠转10min4?#26579;?#32622;10min沉淀700rpm离心1min除去上清
                                                                                                          洗涤溶?#28023;a. low salt wash buffer----one wash
                                                                                                          b. high salt wash buffer-----one wash
                                                                                                          c. LiCl wash buffer------one wash
                                                                                                          d. TE buffer------two wash
                                                                                                          15清洗完毕后开始洗脱洗脱液的配方100ul 10SDS 100ul 1M NaHCO3 800ul ddH2O共1ml
                                                                                                          ?#25239;?#21152;入250ul洗脱buffer室温下颠转15min静置离心后收集上清重复洗涤一次最终的洗脱液为?#25239;?00ul
                                                                                                          16解交联?#22909;抗?#20013;加入20ul 5M NaClNaCl终浓度为0.2M
                                                                                                          混匀65度解交联过夜

                                                                                                          第三天
                                                                                                          一DNA样品的回收
                                                                                                          17解交联结束后?#25239;?#21152;入1ul RNaseAMBI37度孵育1h
                                                                                                          18?#25239;?#21152;入10ul 0.5M EDTA 20ul 1M Tris.HClPH 6.52ul 10mg/ml 蛋白酶K
                                                                                                          45度处理2h
                                                                                                          19DNA片段的回收DDDomega胶回收试剂?#23567;?#26368;终的样品溶于100ul ddH2O

                                                                                                          二PCR分析

                                                                                                           

                                                                                                          ChIP技术总结
                                                                                                          一关于细胞
                                                                                                          细胞的生长状态要好因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合
                                                                                                          一般细胞长到7580比较好

                                                                                                          二关于?#22266;?BR>?#22266;?#26159;实验成败的致命因素之一必须是IP级别的?#22266;?#21478;外如果经济条件许可的话尽量买大厂的?#22266;?#19981;推荐国产?#22266;?#21644;santa cruz的?#22266;?#21363;使是IP级别的
                                                                                                          单抗与多抗的选择也需要仔细考虑两种?#22266;?#21508;有利弊单?#22266;?#24322;性强背景低但是单抗有一个致命的弱点就是识别位点单一而在ChIP甲醛交联的过程中很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭导致单?#20849;?#33021;识别靶蛋白多抗虽然没有这个问题但是多?#22266;?#24322;性较差背景可能会偏高
                                                                                                          一般而言如果没有十足把握单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结?#31995;那?#22495;选择多抗比较稳妥一些

                                                                                                          三关于交联与超声破碎
                                                                                                          这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分交联的程度会影响到超声破碎的效果交联的程度越高超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段
                                                                                                          交联不充分只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合富集得到的Promoter的量不高实验假阴性交联过充分基因组上结合了太多的蛋白对超声破碎造成障碍另外?#19981;?#22686;加背景
                                                                                                          一般来讲按照我的经验交联条件取决于细胞类型不同的细胞系交联的条件也不一样例如NIH3T3的交联条件是室温25摄氏度下15min1的甲醛浓度而别的细胞系则可能完全不一样而超声破碎的条件机器不一样条件也不一样当然如果你有bioruptor这样的神器那么超声破碎对你而言就?#20999;?#33756;一碟了
                                                                                                          一般理想的超声破碎得到的片段大小是200bp1000bp但是200bp2000bp的范围也是可以接受的

                                                                                                          四关于操作
                                                                                                          希望尽可能的保持低温4度
                                                                                                          沉淀的时候可以先在4度放置一会等它自然沉降一些再超低转速500rpm等离心使其完全沉降
                                                                                                          虽然?#24471;?#20070;上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方我还是希望你能够连续把它做完直到PCR结果出来为止尽量避免实验中不可预知的影响因素

                                                                                                          五关于解交联
                                                                                                          虽然?#24471;?#20070;上说4小时已经足够但是我还是希望你可以解交联过夜因为在那样的环境里DNA不会?#21040;?#36807;夜解交联更充分些只是不要忘记在EP管口封上封口膜
                                                                                                          六关于DNA片段的回收
                                                                                                          需要注意的是样品中SDS样品?#32454;]?#26222;通的PCR产物回收试剂盒回收很有可能会在最终的样品中混入SDS影响PCR实验结果
                                                                                                          小Tip过柱前在样品中加入一定量的异丙醇能有效的消除SDS沉淀

                                                                                                           

                                                                                                           
                                                                                                           
                                                                                                          关于我们 联系我们 文件下载 技术文章

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                                                                                                          沪公网安备 31010402001045号

                                                                                                          涓婃捣缃戠珯鍒朵綔
                                                                                                          涓婃捣缃戠珯寤鸿
                                                                                                          ˿淨

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                          鐐瑰嚮杩欓噷缁欐垜鍙戞秷鎭? title=
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                          鐐瑰嚮杩欓噷缁欐垜鍙戞秷鎭? title=